采用UPLC-Q-TOF/MS/MS對(duì)達(dá)立通顆粒體內(nèi)外化學(xué)成分進(jìn)行分析，非目標(biāo)特征濾波器分析并結(jié)合計(jì)
發(fā)布時(shí)間：2022-10-11 15:46:00 | 來源：【藥物研發(fā)團(tuán)隊(duì) 2022-10-11】
采用UPLC-Q-TOF/MS/MS對(duì)達(dá)立通顆粒體內(nèi)外化學(xué)成分進(jìn)行分析，非目標(biāo)特征濾波器分析并結(jié)合計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)策略對(duì)其化學(xué)成分和體內(nèi)代謝物進(jìn)行鑒定
Yan Su，Lin Tao，Xiaoli Zhang，Xianjie Sheng，Qin Li，Wenying Fei，Tao Yin，An Kang，Jiye Aa，Guangji Wang
PII：S0731-7085（22）00507-6
DOI：https：//doi.org/10.1016/j.jpba.2022.115086
引用：PBA115086
引用出處：Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis
接收日期：2022.05.17
修正日期：2022.09.24
接受日期：2022.09.27
引用本文為：Yan Su，Lin Tao，Xiaoli Zhang，Xianjie Sheng，Qin Li，Wenying Fei，Tao Yin，An Kang，Jiye Aa，Guangji Wang，《達(dá)立通顆粒體內(nèi)外化學(xué)成分的超高效液相色譜-Q-TOF/MS/MS分析方法及其在體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究》，《醫(yī)藥與生物醫(yī)學(xué)分析雜志》，（2022）doi：https：//doi.org/10.1016/j.jpba.2022.115086
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采用 UPLC-Q-TOF/MS/MS對(duì)達(dá)立通顆粒體內(nèi)外化學(xué)成分進(jìn)行分析，非目標(biāo)特征濾波器分析并結(jié)合計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)策略對(duì)其化學(xué)成分和體內(nèi)代謝物進(jìn)行鑒定
Yan Su1，Lin Tao2，Xiaoli Zhang2，Xianjie Sheng1，Qin Li1，Wenying Fei1，Tao Yin1，An Kang1*，Jiye Aa3**，Guangji Wang3
1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023；
2.南昌弘益藥業(yè)有限公司，南昌330006；
3.中國藥科大學(xué)代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省藥物代謝與藥代動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009
頁眉標(biāo)題：達(dá)立通顆粒體內(nèi)外化學(xué)成分分析
通訊作者：
*An Kang：南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京仙林大道138號(hào)，210023，中國，Email：kanga@njucm.edu.cn
** Jiye Aa：中國藥科大學(xué)藥物代謝與藥代動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京佟家巷24號(hào)，南京210009，中國，Email：jiyea@cpu.edu.cn
摘要
達(dá)立通顆粒，作為一種強(qiáng)效胃腸動(dòng)力中藥，臨床上用于治療功能性消化不良。對(duì)緩解胃腸動(dòng)力障礙有較好的療效，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。然而，目前對(duì)其體內(nèi)外化學(xué)分析還沒有全面的研究。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS結(jié)合非靶向特征過濾分析和計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)策略（NCFS），推導(dǎo)和鑒別大鼠口服達(dá)立通顆粒后生物樣品中的化學(xué)成分和體內(nèi)代謝產(chǎn)物。本研究從達(dá)立通顆粒中鑒定出108種化學(xué)成分，其中黃酮類化合物50種，生物堿22種，萜類13種，有機(jī)酸11種，香豆素10種，揮發(fā)油2種。在大鼠給藥后的血漿、組織、尿液和糞便樣本中，共推測(cè)出147個(gè)化合物（60個(gè)原型化合物，87個(gè)代謝物）。體內(nèi)代謝途徑主要有甲基化、去甲基化、去糖基化、氫化、羥基化、磺化、葡糖苷醛化等?？傊?，達(dá)立通顆粒中存在大量的黃酮類化合物。綜上所述，采用快速、準(zhǔn)確的分析方法對(duì)達(dá)立通顆粒的化學(xué)成分和代謝物進(jìn)行了全面的鑒定，為其生物活性物質(zhì)的分析奠定了基礎(chǔ)。為深入研究達(dá)立通顆粒藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)及進(jìn)一步綜合開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。
關(guān)鍵詞：達(dá)立通顆粒，化學(xué)成分，代謝物，高分辨質(zhì)譜
1.引言
胃弱又稱消化不良，已經(jīng)越來越普遍了，可分為兩類：“器質(zhì)性”消化不良和功能性消化不良（FD）[1]。FD是臨床常見的功能性胃腸疾病，是指以胃脘痛、餐后加重的胃脘脹、早飽、噯氣、食欲不振、惡心、嘔吐等消化不良癥狀的疾病[2，3]。達(dá)立通顆粒是由柴胡、枳實(shí)、木香、陳皮、清半夏、蒲公英、山楂、焦檳榔、雞矢藤、黨參、延胡索、六神曲12種中藥材組成[4]，是目前應(yīng)用最廣泛的促胃腸動(dòng)力中藥之一。柴胡是達(dá)立通顆粒的主藥，主要治療胃腸氣和飲食積累，可改善功能性消化不良患者的臨床癥狀。枳實(shí)具有化氣清積、化痰祛斑的作用[5]；木香能止痛，用于胃脾氣郁滯引起的腹脹、噯氣、食欲不振等癥狀[6]；陳皮、檳榔子、山楂、延胡索具有降逆氣、和胃、消滯的作用[7，8]。
臨床研究結(jié)果表明，與化學(xué)藥物多潘立酮和西沙必利相比，達(dá)立通顆粒具有促進(jìn)胃排空、腸運(yùn)動(dòng)、止吐和鎮(zhèn)痛的作用。目前，達(dá)立通通聯(lián)合其他方法治療胃腸疾病的報(bào)道較多，但對(duì)其化學(xué)成分分析和鑒定的綜合報(bào)道較少。因此，建立達(dá)立通顆?；瘜W(xué)成分和代謝物的綜合研究方法是很有必要的。
在UPLC-Q-TOF-MS分析之后，我們可以使用非靶向特征過濾分析和在計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)策略（NCFS）中有效地識(shí)別中藥和生物樣品中可能存在的化學(xué)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物。非靶向特征濾波器分析是多重質(zhì)量缺陷濾波器（MMDF）、片段和中性損失濾波器（FNLF）、診斷片段離子濾波器（DFIF）、產(chǎn)物離子濾波器（PIF）、氮規(guī)則濾波器（NRF）的統(tǒng)稱，而在計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)策略中需要使用三個(gè)數(shù)據(jù)庫來預(yù)測(cè)代謝物：BioTransformer（http：//biotransformer.ca/new）、GLORYx （https：//nerdd.univie.ac.at/）和EAWAGPPS （http：//eawag-bbd.ethz.ch/）[9，10]。該整合策略具有高靈敏度、高精度和高分辨率的特點(diǎn)，可用于大鼠給藥后不同生物樣品中原型及其代謝物的成分分析。研究達(dá)立通顆粒的體內(nèi)外化學(xué)成分及可能的代謝物，為深入研究達(dá)立通顆粒的物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)其現(xiàn)代化發(fā)展。
2.實(shí)驗(yàn)
2.1.材料和試劑
甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）（HPLC級(jí)）購自默克公司（Darmstadt，Germany），甲酸（FA）（LC-MS級(jí)）購自Aladdin （Shanghai，China）。使用Milli-Q系統(tǒng)（Millipore，Bedford，MA，USA）進(jìn)行超純水凈化。達(dá)立通顆粒（批號(hào)：210342）由南昌弘益藥業(yè)有限公司生產(chǎn)、提供。
Saikosaponin A和Saikosaponin D來自Mansite生物技術(shù)有限公司（中國成都）。檳榔堿、綠原酸、阿曲柳苷、原兒茶酸、雞皮苷、黃連堿、麻瓜堿、巴馬汀、黃連素、原托堿、傘形花酮、牡荊素4”-o-葡萄糖苷、金菊素、異綠原酸B、二氫車菊堿均來自成都普飛德生物科技有限公司。橙皮苷、木犀草素、芹菜素購自上海源業(yè)生物科技有限公司。槲皮素、蘆丁購自中國食品藥品檢定研究院，1-咖啡酰奎寧酸、大麥芽堿、咖啡酸、金絲桃苷、阿魏酸、聚氰胺糖苷、甲基橙皮苷、橙皮苷、木質(zhì)素內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、花青素，檸檬素、山柰素、橙皮素、黃芩苷、山奈酚、四氫巴馬汀、柚皮苷、奧拉蓬素購自中國成都中草藥有限公司。
2.2.儀器和UPLC條件
UPLC-Q-TOF/MS/MS（AB SCIEX）分析系統(tǒng)由UPLC系統(tǒng)（LC-20A，Shimadzu）耦合到配備電子噴霧電離（ESI）的四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（AB SCIEX）組成。采用Hypersil GOLDTM色譜柱（3 m，2.1 mm 100 mm），柱溫40℃，流速0.4 mL/min。流動(dòng)相A為水和FA（0.1%， v/v），流動(dòng)相B為乙腈。洗脫過程按以下梯度進(jìn)行：0-2分鐘，5% B；2-25分鐘，60% B；25-28分鐘，90% B；28-30分鐘，90% B；30-32分鐘，5% B；32-36分鐘，0。進(jìn)樣量為3 μL。
質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：正離子/負(fù)離子模式下掃描范圍均為m/z 50- 1500。帷幕氣（GUR）為40 psi；霧化氣體（GS1）和輔助氣體（GS2）均為55 psi；離子噴霧電壓設(shè)置為5500 V/-5500 V；碰撞能量為10 V或-10 V；去簇電壓為100 V/-100 V；ESI溫度為550℃。
2.3.達(dá)立通顆粒的萃取
取達(dá)立通顆粒2.875 g，相當(dāng)于藥材5 g，加入80%甲醇10 mL，振蕩30 min，離心10min，取上清液。用真空離心濃縮器（Thermo Scientific）將上清液在45℃下干燥，殘?jiān)?00 μL甲醇中重新溶解，確保最終濃度為6.25 g粗品/mL。
2.4.動(dòng)物和給藥
雄性SD大鼠8只（180～220g），由杭州醫(yī)學(xué)院（中國浙江）提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)為SYXK（浙）-2019-0002。所有動(dòng)物治療均根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。動(dòng)物研究方案經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)期刊動(dòng)物倫理委員會(huì)預(yù)審?fù)ㄟ^。
這些大鼠被安置在標(biāo)準(zhǔn)條件下（室溫22±2℃；相對(duì)濕度55±5%；并在一周內(nèi)進(jìn)行12小時(shí)的明暗交替循環(huán)），允許自由進(jìn)食和飲水。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，給藥前將大鼠隨機(jī)分為兩組（n = 4/組），對(duì)照組和達(dá)立通顆粒治療組。達(dá)立通顆粒治療組取2只大鼠血漿樣本，另取2只大鼠尿、糞樣本。每天灌胃1次（上午8：30均勻灌胃），按11.2 g/kg生藥（約為臨床劑量的4倍）灌胃7天，有利于大鼠生物樣本中發(fā)現(xiàn)更多吸收的原型物和代謝物。同時(shí)，對(duì)照組大鼠灌胃等量水。
2.5.樣品預(yù)處理
在最后一次給藥后的0.5、1、2、4、6、8 h，用肝素化離心管采集眼靜脈血液樣本。在5000 rpm離心10 min后收集上清液，將0.5 h和1 h、2 h和4 h、6 h和8 h的上清組合液為血漿1（P1）、血漿2（P2）和血漿3（P3）。不同時(shí)期的血漿樣本采集和組合的目的是檢測(cè)出更多的血漿原型和代謝物。加入3倍乙腈沉淀血漿中的蛋白質(zhì)后，上清液蒸發(fā)至干燥，加入200 μL甲醇溶解殘?jiān)?。最后，?℃，12，000 rpm離心10分鐘，將上清液注入UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)。
末次給藥（等劑量水）后，將兩組大鼠分別放入代謝籠中收集尿液和糞便。將尿樣與超純水按1：1混合，共3ml，5000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液。將上清液蒸發(fā)至干燥，再加入200 μL甲醇溶解殘?jiān)?。最后，?℃，12，000 rpm離心10分鐘，將上清液注入UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)。
糞便樣品，將0.2 g糞便加入0.8 mL 80%乙腈中，旋渦10分鐘，以5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，得到上清液。上清液蒸發(fā)至干，用200 μL甲醇溶解殘液。最后，在4℃，12，000 rpm離心10分鐘，將上清注入U(xiǎn)PLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)。
同樣的，采集大鼠的胃、肝、腎、空腸和結(jié)腸。2 mL EP管中各取0.2 g，加入0.8mL 80%乙腈研磨成勻漿。離心后收集上清液并干燥，加入200 μL甲醇溶解。12000 rpm離心10 min后收集上清，注入U(xiǎn)PLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)。
3.結(jié)果與討論
3.1達(dá)立通顆?；瘜W(xué)成分的鑒定
UPLC-Q-TOF-MS/MS分析系統(tǒng)結(jié)合非靶向特征濾波分析和計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)策略（NCFS）的化學(xué)成分體內(nèi)外鑒定主要包括四個(gè)步驟，具體信息見圖1[11，12]。首先，采用UPLCQ-TOF-MS進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；與信息依賴采集（IDA）測(cè)試相對(duì)應(yīng)的結(jié)合動(dòng)態(tài)背景減法（DBS）設(shè)置的在線數(shù)據(jù)采集方法，能夠高效、靈敏地區(qū)分背景干擾離子和目標(biāo)離子[13，14]。通過上述步驟，結(jié)合文獻(xiàn)和TCMSP數(shù)據(jù)庫[15]，建立了包含保留時(shí)間、主要片段離子等多種質(zhì)譜信息的達(dá)立通顆粒化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。其次，在PeakView software aretm TM（AB SCIEX）應(yīng)用的基礎(chǔ)上，總結(jié)了主要參考物質(zhì)的破碎規(guī)律。采用離子色譜（XIC）提取和質(zhì)譜特征過濾功能，包括片段和中性損失過濾器（FNLF）、診斷片段離子過濾器（DFIF）、產(chǎn)物離子過濾器（PIF）和氮規(guī)則過濾器（NRF），對(duì)采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)[16]進(jìn)行分析。該步驟可以提供準(zhǔn)確的MS2信息，以快速有效地篩選目標(biāo)化合物并推測(cè)目標(biāo)化合物的部分代謝物。第三步，利用BioTransformer、GLORYx和EAWAG-PPS[17]對(duì)達(dá)立通顆粒的代謝物進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用Peakview SoftwareTM（AB SCIEX）對(duì)不同生物樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，采用多重質(zhì)量缺陷濾波（MMDF）、片段和中性損失濾波（FNLF）、診斷片段離子濾波（DFIF）、產(chǎn)物離子濾波（PIF）和氮規(guī)則濾波（NRF）策略。并利用上述步驟中發(fā)現(xiàn)的原型物質(zhì)的破碎規(guī)律和大鼠口服達(dá)立通顆粒后產(chǎn)生的代謝物進(jìn)行初步鑒定。最后，在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，結(jié)合上述鑒定的原型和代謝物，對(duì)達(dá)立通顆粒中不同類型化學(xué)成分的代謝途徑進(jìn)行總結(jié)[18-20]。
達(dá)立通顆粒中鑒定出的化學(xué)成分及相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表S1。在達(dá)立通顆粒中共檢出108種化合物，其中類黃酮50種，生物堿22種，萜類13種，有機(jī)酸11種，香豆素10種，揮發(fā)油2種。其中43個(gè)化合物通過與對(duì)照物的保留時(shí)間和主要片段離子的比較，進(jìn)一步得到了明確的確認(rèn)。達(dá)立通顆粒在正離子（A）和負(fù)離子（B）模式下的基峰色譜（BPC）如圖2所示。達(dá)立通顆粒的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)配方分類如圖3所示。圖4為達(dá)立通顆粒中四種典型化合物（柚皮苷4’-葡萄糖苷、氫化小檗堿、雞矢藤甙酸和奎寧酸）的提取離子色譜圖、MS/MS光譜和解理圖，對(duì)其代謝產(chǎn)物的推測(cè)和驗(yàn)證具有重要意義。
3.1.1類黃酮
采用UPLC-Q-TOF-MS 法測(cè)定達(dá)立通顆粒中黃酮類化合物含量為20種。而本研究通過PIF、FNLF和DFIF策略，發(fā)現(xiàn)并鑒定了50種黃酮類化合物，包括黃酮苷元、黃酮O-糖苷和黃酮C-糖苷[21]。黃酮苷元的裂解模式主要有兩大類。類黃酮C環(huán)上典型的反向- diels -alder（RDA）反應(yīng)可產(chǎn)生診斷離子。通過比較化合物的產(chǎn)物離子和診斷離子的元素差異，推測(cè)類黃酮取代基的位置和類型。此外，中性分子（CH3、CO和CO2）的丟失可以產(chǎn)生識(shí)別化合物[22]的特征產(chǎn)物離子。例如，甲烷的丟失是甲氧基黃酮類化合物的特征。除了上述兩種主要的裂解模式外，黃酮O-糖苷還可以通過失去糖苷鍵產(chǎn)生片段離子。146 Da、162 Da和176 Da的丟失表明分別存在O-鼠李糖（Rha）O-糖苷（Glc）和葡萄糖醛酸酯（Glu）[23]。此外，O-糖基黃酮的片段離子主要由糖環(huán)的裂解產(chǎn)生，包括中性片段（90 Da、150 Da）的丟失和診斷離子片段（120 Da）的丟失。因此，黃酮O苷和黃酮C苷可以通過不同的片段離子來區(qū)分。
化合物43（C27H32O14，tR=9.115 min）的光譜顯示為m/z 581.1855 [M+H]+準(zhǔn)分子離子，產(chǎn)物離子m/z 435.1292 [M+H- Rha]+，273.0756 [M+H- Rha - Glc]+和診斷離子153.0184 [M+H- Rha - Glc - C8H8O]+?；衔?/span>49（C27H32O14，tR=9.408 min）產(chǎn)生一個(gè)m/z 581.1856 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子，在MS2中檢測(cè)到診斷離子m/z 273 [M+H- Rha -Glc]+。這兩種化合物的片段離子基本是相同的[24]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，柚皮苷蕓香苷是一種與柚皮苷苷元連接的蕓香苷，它更傾向于去除末端的鼠李糖的一個(gè)分子，與葡萄糖殘基生成苷元離子m/z 435。因此，m/ z435離子片段的相對(duì)豐度較高；柚苷是一種與柚皮苷苷元連接的新橙皮糖。同時(shí)容易去除雙糖，因此m/ z273離子片段相對(duì)豐度較高。因此，推測(cè)C43為柚皮蕓香苷， C49為柚苷。
化合物30（C33H42O19，tR=7.946 min）（圖4a）在m/z 743.2404 [M+H]+和m/z 741.2240 [M-H]-處分別為準(zhǔn)分子離子。產(chǎn)物離子在m/z 435.1278 [M+H-Glc-Rha]+，417.1170 [M+H-Glc - Rha- H2O]+和診斷離子273.0755 [M+H-2Glc-Rha]+、153.0176（1，3A -）[M+H-2Glc-Rha-C8H8O]+以正離子模式存在，片段離子M /z 621.1672 [M- H]-和診斷離子M /z 271.0591 [M-H-2Glc-Rha]-、151.0029（1，3A-） [M-H-2Glc-Rha-C8H8O]-以負(fù)離子模式存在。因此，推測(cè)C30為柚皮蕓香苷 4 -葡萄糖苷[24]?；衔?/span>53 （C28H34O15，tR=9.646 min）為m/z 611.1961 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子。檢測(cè)到的片段離子為m/z 465.1387 [M+H- Rha]+、303.0862 [M+H - Rha - Glc]+、177.0550 [M+H - Rha - Glc-C6H6O3]+、153.0187 [M+H-Rha-Glc- C9H10O2]+（診斷離子）。將C53與對(duì)照物的片段信息進(jìn)行比對(duì)，鑒定為橙皮苷[25]。
化合物79（C15H10O5，tR=12.986 min）表現(xiàn)為m/z 271.0600 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子。產(chǎn)物離子位于m/z 243.0603 [M+H-CO]+、153.0176 [M+H-C8H6O]+ （1，3A-）（診斷離子）和119.0502 [M+H-C7H4O4]+ （1，3B -）（互補(bǔ)片段離子），這是黃酮類化合物C環(huán)X1，3裂解產(chǎn)生的特征離子片段。這意味著在A環(huán)上有兩個(gè)羥基取代，在B環(huán)上有一個(gè)羥基取代。通過與對(duì)照物的片段信息比較，C79被鑒定為芹菜素[24]。
3.1.2.生物堿類
本研究從達(dá)立通顆粒提取液中鑒定出23種生物堿和其他含氮化合物，主要來自延胡索和雞矢藤。氮規(guī)則是指不含氮或偶氮的有機(jī)質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為偶，含奇氮的有機(jī)質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為奇，可用于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的過濾。根據(jù)氮規(guī)則，有些生物堿更容易生成一個(gè)易于檢測(cè)的準(zhǔn)分子離子[M]+，有些生物堿在正離子模式下生成一個(gè)準(zhǔn)分子離子[M+H]+，而失去含氮基團(tuán)。此外，PIF、DFIF和FNLF策略仍然適用于生物堿的鑒定?；衔?（C8H13NO2，tR=0.953 min）在m/z 156.1019[M+H]+處生成準(zhǔn)分子離子。產(chǎn)物離子在m/z 138.0570 [M+H-H2O]+，124.0753 [M +H-OCH3]+和1313.0584[M + H-C2H6N] +被發(fā)現(xiàn)。因此，通過與對(duì)照物的片段信息比較，推斷C1為檳榔堿?；衔?7 （C20H21NO4，tR=9.906 min）（圖4b）為m/z 340.1544 [M+H]+的準(zhǔn)分子離子。176.0712 [M+H-C10H12O2]+（豐度最高的片段離子和診斷離子）、165.0914 [M+H-C10H9NO2]+（互補(bǔ)片段離子）和149.0607 [M+HC11H13NO2]+的產(chǎn)物離子證實(shí)了典型的RDA-解離特征，這是由于苯甲酰氧基和含氮基團(tuán)的連續(xù)丟失。通過與對(duì)照物的片段信息比較，確定其為氫化小檗堿。
3.1.3.萜類
本研究從達(dá)立通顆粒中鑒定出13個(gè)萜類化合物，包括倍半萜、環(huán)烯醚萜和三萜皂苷（五環(huán)三萜苷）。雞矢藤的主要成分是萜類化合物，如芍藥苷、單肌豆苷、曲柳苷和芍藥苷酸（圖4c）等。部分萜類化合物優(yōu)先失去中性的小分子，包括H2O、CO2、CH3和CO，部分皂苷會(huì)先失去糖苷變成小分子。146 Da和162 Da的丟失表明O-焦點(diǎn)和O-糖苷的存在。因此，利用FNLF和PIF的策略可以對(duì)萜類[26]進(jìn)行過濾和識(shí)別。如C2、C23、C104和C105為萜類化合物，其特征片段表現(xiàn)為CO2和H2O的中性損失?；衔?（C16H22O11，tR=1.146 min）在m/z 389.1088 [M-H]-范圍內(nèi)生成準(zhǔn)分子離子。在MS2中可以檢測(cè)到m/z 227.0545 [M-H -Glc]-、209.0439 [M-H-Glc-H2O]-、191.0334 [M-H-Glc-2H2O]-、183.0654 [M-H-Glc -CO2]-、179.0551 [M- H- Glc - CH4O2]-、165.0548 [M-H-Glc - C2H6O2]-、147.0447 [M-H-Glc - 2H2O]-處的產(chǎn)物離子。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，C2被鑒定為水晶蘭苷。木香內(nèi)酯（化合物104，C15H20O2，tR=20.345 min）和去氫木香內(nèi)酯（化合物105，C15H18O2，tR=20.734 min）是木香的主要成分，也屬于萜類化合物。以前者為例，C104在m/z 233.1533 [M +H]+處產(chǎn)生了一個(gè)準(zhǔn)分子離子，發(fā)現(xiàn)特征片段m/z 215.1408 [M+H- H2O]+和m/z 187.1476 [M+H-CO2-2H]+ 這是由丟失的水（18 Da）、二氧化碳和2H （46 Da）產(chǎn)生的。推測(cè)C104為木質(zhì)素內(nèi)酯，并通過與對(duì)照物的片段信息對(duì)比進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。
柴胡皂苷是柴胡的主要成分，屬于β-芳香樹脂烷基三萜。62 Da和58 Da的損失分別代表C2H6O2和C2H2O2的損失。因此，PIF、FNLF和DFIF策略同樣適用于柴胡皂苷[27]的鑒定。化合物103 （C44H70O14，tR=19.836 min）的m/z為821.4697 [M - H]-。在MS2中檢測(cè)到產(chǎn)物離子m/z為779.4620 [M-H-C2H2O]-、617.4080 [M-H - Glc - C2H2O]-和471.3490 [M-H- Glc - Fuc - C2H2O]-（診斷離子）。通過與對(duì)照物的片段信息比較，推測(cè)C103為3”- O -乙酰柴胡皂苷D [28]。
3.1.4.有機(jī)酸
采用FNLF和PIF方法，在達(dá)立通顆粒提取液中分離出11種有機(jī)酸化合物。中藥山楂的主要成分為有機(jī)酸，如綠原酸、咖啡酸、齊墩果酸、奎寧酸等（圖4d）。這些化合物在負(fù)離子模式下更容易被檢測(cè)到，主要是H2O、CO2和CH3等小分子碎片的丟失?；衔?/span>5 （C7H6O4，tR=1.877 min）為[M-H]-準(zhǔn)分子離子，m/z為153.0199。在m/z 109.0302 [M-H-CO2]-， 108.0215 [M-H-HCOO]-和91.0194 [M- H- CO2 - H2O]-處發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)物離子。因此，推測(cè)C5為原兒茶酸。
3.1.5.香豆素
從達(dá)立通顆粒中鑒定出10種香豆素。這些化合物主要從中藥枳實(shí)和山楂中分離得到，包括枳酚、傘形花酮、東莨菪素、枳烯、環(huán)氧枳烯和黃當(dāng)歸醇?；衔?1 （C17H16O6，tR=11.374 min）在M /z 317.1020處有一個(gè)[M+H]+的準(zhǔn)分子離子，該離子裂解后失去C7H10O2（126 Da），生成片段M /z 191.0701，失去C9H8O3 （164 Da），得到特征片段M /z 153.0176。通過與文獻(xiàn)報(bào)道的片段信息對(duì)比，推測(cè)化合物71為甜菊糖。
化合物78（C19H22O4，tR=12.588 min）在M /z 315.1593處有一個(gè)[M+H]+準(zhǔn)分子離子，通過母離子裂解損失的C9H16O （140 Da）、C10H16O（152 Da）和C9H6O3（162 Da）得到M /z 175.0366、163.0385和153.1271處的特征片段離子。比較片段信息，推測(cè)C78為環(huán)氧枳烯。
3.1.6.其他化合物
質(zhì)譜分析結(jié)果表明，達(dá)立通顆粒提取液中含有兩種揮發(fā)油化合物?；衔?/span>87 （C10H14，tR=14.608 min）為[M+H]+準(zhǔn)分子離子，M/z為135.1167。m/z為91.0556 [M+H-C3H8]+和77.0403 [M+H-C4H10]+的片段離子，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)C87為p-傘花烴。
3.2.體內(nèi)吸收成分和代謝物的鑒定
首先，以達(dá)立通顆粒提取液的鑒定結(jié)果為基礎(chǔ)，采用XIC法對(duì)大鼠吸收的原型化合物進(jìn)行鑒定；接下來，在計(jì)算機(jī)代謝物預(yù)測(cè)中預(yù)測(cè)吸收的原型化合物的潛在代謝物，包括BioTransformer、gloria和EAWAG-PPS[10]。前兩者可以預(yù)測(cè)I相和II相代謝的產(chǎn)物，最后一個(gè)可以預(yù)測(cè)化合物可能的生物降解，包括常見的代謝轉(zhuǎn)化。采用PeakView SoftwareTM和XIC軟件對(duì)預(yù)測(cè)的代謝物進(jìn)行識(shí)別，并與原型和文獻(xiàn)進(jìn)行比較，確定的準(zhǔn)確質(zhì)量、保留時(shí)間和片段離子，采用MMDF、DFIF、PIF和FNLF策略進(jìn)行篩選。最后，推導(dǎo)出可能的代謝途徑[29]。
通過上述步驟，在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)中總共預(yù)測(cè)了978種可能的代謝物。然后，我們使用MMDF過濾不同生物樣品中的潛在代謝物[30]。將原型的公式輸入PeakView SoftwareTM，然后分別設(shè)置不同的MDF模板，包括原型、葡萄糖醛酸化、硫酸化等[31]。接下來，通過可能的代謝途徑和質(zhì)量缺陷耐受性過濾代謝物。I相和II相代謝物的缺陷通常設(shè)置為±50 mDa，每個(gè)模板窗口的缺陷窗口設(shè)置為100 mDa。此外，還利用DFIF、PIF和FNLF功能對(duì)體內(nèi)代謝物進(jìn)行鑒定和確認(rèn)。不同類型代表化合物的質(zhì)譜信息包括準(zhǔn)確質(zhì)量、保留時(shí)間、特征片段和診斷離子在內(nèi)的可用于過濾代謝物。例如，273/271（C15H12O5）和153/151（C7H4O4）是類黃酮代謝物碎片產(chǎn)生的兩個(gè)重要碎片離子，包括正離子和負(fù)離子模式下的羥基化產(chǎn)物、葡萄糖醛酸結(jié)合物和硫酸鹽結(jié)合物。最后，如表S2所示，大鼠灌胃達(dá)立通顆粒后發(fā)現(xiàn)60種原型化合物和87種代謝物，包括80種黃酮類化合物、29種萜類化合物、21種生物堿、10種有機(jī)酸和7種香豆素。此外，結(jié)果表明，大鼠胃、血漿、肝臟、腎臟、空腸、結(jié)腸、尿液和糞便中的原型化合物和代謝物的數(shù)量存在差異。一方面這可能是由于大鼠生物樣本中發(fā)現(xiàn)的化合物濃度和MS片段的豐度不同所致。另一方面，達(dá)立通顆粒中不同類型化合物的首選代謝器官和代謝途徑可能不同。例如，I相主要發(fā)生在肝臟[32]。達(dá)立通顆粒中六種典型代謝物的提取離子色譜、MS/MS譜和裂解模式（柚皮苷的硫酸化和葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物、芹菜素的甲基化代謝產(chǎn)物、巴馬汀的去甲基化、羥基化和葡醛酸代謝物、巴馬汀的去甲基代謝產(chǎn)物、氨甲酰糖苷的去糖基化代謝產(chǎn)物以及柴胡皂苷D的去糖基化和去甲基化為羧酸代謝產(chǎn)物）如圖5所示。
3.2.1.體內(nèi)原型成分的鑒定
在大鼠的生物樣品中發(fā)現(xiàn)了60種原型成分，包括33種黃酮類化合物、11種生物堿、7種萜類化合物、6種香豆素和3種有機(jī)酸。血漿中發(fā)現(xiàn)了21種原型成分，包括原兒茶酸（P5）、氰菊酯（P35）、黃連素（P45）、李寧（P48）、四氫巴馬?。≒52）、橙皮苷（P53）、地奧司明（P54）、芍藥苷（P63）、木犀草素（P70）、櫻皮素（P73）、異櫻皮苷（P76）、環(huán)氧烏拉pten（P78）、芹菜素（P80）、3'，7-二甲基槲皮素（P81）、鼠李素（P84）、環(huán)氧麥角菌素（P86）、5-6-二羥基-7，4'-二甲氧基黃酮（P91）、桂皮素（P94）、5-6-二羥基-7，4'-二甲氧基黃酮（P101）、木香內(nèi)酯（P104）、和脫氫殼內(nèi)酯（P105），這表明黃酮類化合物是主要的口服達(dá)立通顆粒后吸收有效成分。此外，在胃中發(fā)現(xiàn)51種代謝物，在肝臟中發(fā)現(xiàn)8種，在腎臟中發(fā)現(xiàn)15種，在空腸中發(fā)現(xiàn)16種，在回腸中發(fā)現(xiàn)11種，在尿液中發(fā)現(xiàn)39種，在糞便中發(fā)現(xiàn)16個(gè)。圖S1顯示了空白組大鼠血漿樣品和服用達(dá)立通顆粒的血漿樣品通過UPLC-Q-TOF-MS顯示的正離子模式和負(fù)離子模式下的基峰色譜圖（BPC）。從圖S2到圖S8可以看到其他生物樣品的正離子模式和負(fù)離子模式基峰色譜圖（BPC），包括組織樣本、尿液樣本和糞便樣本。
3.2.2.體內(nèi)類黃酮相關(guān)成分的鑒定
類黃酮是達(dá)立通顆粒的主要成分，在大鼠的生物樣品中鑒定出80種類黃酮相關(guān)原型和代謝物。如圖6所示，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物的主要代謝途徑為甲基化、乙酰化、磺化和葡萄糖醛酸化[33]。例如，根據(jù)m/z 271.0617[M-H]-，151.0033[M-H-C8H8O]-處的診斷離子和m/z 119.0505[M-H-C-C7H4O4]-處的碎片離子，P77（C15H12O5，tR=12.524 min）被推斷為柚皮素。結(jié)果表明，通過設(shè)置硫酸化和葡萄糖醛酸化兩種MDF模板，M23（C21H20O14S，tR=8.307 min）的光譜在M/z 527.0501處具有準(zhǔn)分子離子[M-H]-。m/z 447.090，2351.0093處的碎片離子和MS2光譜中的診斷離子271.0580表明SO3和Glu損失。因此，M23被推斷為葡萄糖醛酸化和硫酸化P77的代謝物。
P79（C15H10O5，tR=12.563 min）根據(jù)其在m/z 271.0601[M+H]+（診斷離子）和243.0648[M+H-CO]+（正離子模式）以及269.0456[M-H]-（負(fù)離子模式）的片段離子推斷為芹菜素。m/z 153.0190[M+H-C8H6O]+下的產(chǎn)物離子（診斷離子）和119.0521[M+H-C7H4O4]+通過RDA反應(yīng)得到，表明A環(huán)上有羥基雙取代基，B環(huán)上有羥單取代基[20，24]。MDF發(fā)現(xiàn)M51的準(zhǔn)分子離子（C16H12O5，tR=11.062 min）（圖5B）比P79高14 Da，M40的片段離子167.0309比P79的診斷離子153.0190高14 Da，表明甲基化結(jié)合位點(diǎn)位于A環(huán)上[15]。因此，M51可能是P79的甲基化代謝產(chǎn)物，代謝物M31（C21H18O11，tR=9.004 min）在m/z 445.0766[m-H]處顯示出準(zhǔn)分子離子，比P79高176 Da，其在m/z 269.0447和254.0229處的MS2產(chǎn)物離子對(duì)應(yīng)于負(fù)離子模式下的P79。因此，M31是P79的葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物。如表S2所示，總結(jié)了生物樣品中類黃酮相關(guān)原型和代謝物的詳細(xì)信息。
3.2.3.體內(nèi)生物堿相關(guān)成分的鑒定
共鑒定出23種生物堿相關(guān)原型和代謝物，主要存在于胃和尿液中。如圖7所示，發(fā)現(xiàn)生物堿的主要代謝途徑是氫化、羥基化、葡萄糖醛酸化、去氫、去甲氧基化和環(huán)裂解。例如，C64（C21H22NO4+，tR=10.608 min）通過其在m/z 352.1543[M]+、336.1230[M-CH4]+、322.1072[M-2CH3]+（診斷離子）、308.1284[M-CH4-CO]+和119.0505[M-H-C7H4O4]-處的產(chǎn)物離子推斷為巴馬汀。同樣，使用不同的MDF窗口和PIF、FNLF和DFIF策略過濾生物堿相關(guān)代謝物。MDF計(jì)算表明，代謝產(chǎn)物M35（C20H20NO4+，tR=9.442 min）（圖5D）比C64低14 Da，M54（C21H20NO4]，tR=11.420 min）比C64低2 Da。M35在m/z 338.1392[M]+處顯示出準(zhǔn)分子離子。在m/z 322.1073和294.1133處發(fā)現(xiàn)的碎片離子源于母體離子的16 Da（-CH4）和28 Da（-CO）的連續(xù)損失。因此，M35被推斷為巴馬汀的脫甲基產(chǎn)物。M54的主要碎片離子位于m/z 350.1367[M]+、306.1324[M-CH4-CO]+，表明M54可能是巴馬汀的脫氫產(chǎn)物。此外，代謝物M27（C25H28NO11+，tR=8.472 min）（圖5C）比巴馬汀高166Da。M27在m/z 518.1662[M]+處顯示出準(zhǔn)分子離子。在m/z 342.1335和324.1147處發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物離子，其來源于母體離子連續(xù)損失176 Da（-Glu）和18 Da（-H2O）。m/z處發(fā)現(xiàn)的碎片離子176.0714[M-Glu-C10H14O2]+（診斷離子），提示M27可能是C64的雙脫甲基、羥化酶和葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[34]。
3.2.4.體內(nèi)萜類相關(guān)成分的鑒定
共鑒定出30種萜類相關(guān)原型和代謝物，主要存在于胃、尿液和糞便中。萜類主要包括倍半萜內(nèi)酯、環(huán)烯醚萜和三萜皂苷。如圖8所示，在本研究的數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)萜類化合物的主要代謝途徑是氫化、脫糖基化和脫氫。以代謝物M72（C36H56O10，tR=19.012 min）（圖5F）為例，顯示了鑒定過程。M72的光譜在M/z 647.3784處顯示出[M-H]-準(zhǔn)分子離子。在m/z 471.3491處發(fā)現(xiàn)診斷離子，根據(jù)母體離子顯示損失176 Da（-Fuc-2O+2H）。MMDF計(jì)算表明，柴胡皂苷D在M/z 779.4562處顯示出[M-H]-準(zhǔn)分子離子，比在M72的MS2光譜中發(fā)現(xiàn)的M/z 647.3784高132Da。在m/z 617.4080和m/z 471.3491處發(fā)現(xiàn)診斷離子，其來源于母體離子的162 Da（-Glc）和146 Da的連續(xù)損失。因此，M72被確定為柴胡皂苷D的脫糖基和脫甲基反應(yīng)生成羧酸（-2H+2O）產(chǎn)物。
4.結(jié)論
利用UPLC-Q-TOF-MS/MS和NCFS技術(shù)，我們?cè)谶_(dá)立通顆粒中鑒定出108種化學(xué)成分；在大鼠口服達(dá)立通顆粒后的生物樣本中共推測(cè)出147種化學(xué)成分（60種原型化合物和87種代謝物）。我們的數(shù)據(jù)將有助于深入研究達(dá)立通顆?？赡艿乃幚砦镔|(zhì)基礎(chǔ)。
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